18321664727
返回首頁 在線留言 聯系我們
首頁 > 技術支持 > ELISA實驗必看;ELISA試劑盒使用操作要點

技術支持

ELISA實驗必看;ELISA試劑盒使用操作要點
更新時間:2023-10-24   點擊次數:101次

  ELISA實驗必看;ELISA試劑盒使用操作要點


  酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 因其操作簡單,靈敏度高,特異性好,經濟安全等特點而在臨床上廣泛應用,但是由于其操作步驟復雜,一般包括試劑準備,樣本收集,加樣,溫育,洗滌,顯色,比色,結果判定等,其中任何一項操作不當都會對檢測結果產生很大影響。因此,必須加強ELISA檢測的全面質量控制,保證其結果的準確可靠。

  1 試劑

  試劑是保證檢驗質量的基礎。從4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20~30 min 后再啟用,否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質分子的均勻分布。未用完的試劑和質控品應密封并及時放回冰箱保存。根據蛋白質在冷凍過程中出現蛋白分子分布改變的特點,試劑正式啟用前應充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等,都必須調整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質量一致,因此必須選擇和訂購長批號的試劑,并保證保存條件,嚴格執行這一標準可以避免試劑批號改變而重建質控體系及重新評估試劑的復雜過程,并且能夠保證結果的穩定性。

  2 標本

  患者標本中有可能含有干擾試驗的免疫物質,導致假陽性或假陰性的結果,干擾因素一般可分為兩類,即內源性和外源性干擾因素。內源性干擾因素一般包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等,避免內源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑;外源性干擾因素包括標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長及標本凝固等。要注意避免標本出現嚴重溶血,標本中血紅蛋白中含有血紅素基因,其具有類過氧化物的活性,因此,在以辣根過氧化物酶(HRP)為標記的ELISA測定試驗中,容易在溫育過程中吸附于固相,從而與加入的底物反應顯色。標本在低溫下保存時間過長,IgG可聚合成多聚體,在間接法ELISA測定中會導致本底加深,甚至出現假陽性結果。通常血清標本可在2~8℃保存1 周,冷凍保存時間會更長。血清標本應充分離心,否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結果。冷凍保存標本避免反復凍融,標本的反復凍融會因其所產生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產生破壞作用,使抗體效價下降從而引起假陰性結果。標本的采集及分離要注意盡量避免細菌的污染。此外,標本在凍存時會因蛋白質局部濃縮分布不均,因此重新溶解的標本必須混勻,但不要劇烈振蕩和反復顛倒。

  3 操作因素

  3.1 加樣

  加樣器是一種比較精密的工具,其在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內附著的血痂等原因造成加樣不準,因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的標本均需更換吸嘴,以免發生交叉污染;加樣速度不可太快,以免將標本加在孔壁上部,并注意不要濺出或產生氣泡,加樣時還應注意操作時差對結果的影響,尤其對競爭法檢測結果影響更大。因此建議在加酶結合物和底物時用多道加液器,或者雙人同時加樣以減少操作時差對結果的影響,另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應。稀釋的方式非常重要,最佳方式是采用振蕩器混勻,不可隨意改變混勻方式。

  3.2 溫育

  3.2.1溫育的溫度:育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度,也是大多數抗原抗體結合的最適反應溫度??乖贵w反應一般在37℃經1~2 h 產物的生成可達,為加速反應,可在一定范圍內提高反應的溫度并在反應過程中連續振蕩來增加抗原抗體接觸的概率??乖贵w反應在4℃更為,形成的產物更多、更穩定,但因所需時間太長,在ELISA檢測中一般不予采用。

  3.2.2溫育的方式:溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異(即“邊緣效應")??蓪LISA板置于水浴箱中,板底應貼著水面,使溫度迅速平衡,為避免蒸發,可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱,ELISA板應放在濕盒內,濕盒要選用傳熱性良好的材料(如金屬等),在盒底墊濕的紗布,最后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應板不能重疊放置,防止溫度擴散的不均勻性。

  3.3 洗滌

  洗滌是ELISA不同于均相免疫學檢測技術的一大特征,洗滌在整個ELISA反應過程中雖不是一個反應步驟,卻非常關鍵。其目的是去除反應體系中與反應無關的成分,包括未結合的酶結合物以及反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。洗滌液通常為含有一定濃度Tween 20 的緩沖液,Tween 20 是一種非離子去垢劑,既含親水基團,又含疏水基團,在洗滌中的作用機制是借助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團形成疏水鍵,從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下,促進蛋白質分子脫離固相而進入液相,最終被洗脫。必須注意非離子去垢劑的使用濃度,常用的洗滌液是含0.05 %Tween20,pH為中性的磷酸鹽緩沖液,如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ,可使包被于固相上的抗原抗體解吸附而影響實驗的測定下限。洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩種方式,手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何,在向板內注液時應當避免氣泡殘留孔內,否則會因洗滌液難以進入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時,要保證洗板機上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液吸凈,要求洗板后殘液小于2 μL,即人工扣板墊紙不濕,浸泡時間超過45 s。

  3.4 顯色

  大多數情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶(ALP)。HRP可催化的底物為過氧化氫,參加反應的顯色供氫體有鄰苯二胺(OPD)、鄰聯甲苯胺(OT)及四甲基聯苯胺(TMB)等。其中OPD 難溶于水,見光易變質,使用前配制,反應過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應產物為藍色,目視對比鮮明,其性質穩定,對人體無毒。若選用各類酸性終止液,則會使藍色轉變為黃色。TMB作底物時的產物檢測波長為450 nm ,ALP 作為標記物,其底物一般采用對硝基苯磷酸酯(pNPP),產物為黃色的對硝基酚,吸收波長是405 nm。為了保證結果的穩定性,必須要嚴格按照試劑盒說明書中規定的溫度和時間操作,不可隨意改變溫度和時間。

  3.5 比色

  ELISA 顯色結果必須通過酶標儀進行檢測,不可由肉眼判斷結果,因為不同個體的色覺存在差異,尤其是對于乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體這樣的檢測項目,肉眼難以判斷。酶標儀應采用雙波長進行測定,包括對顏色產物敏感和不敏感的2個吸收峰波長,用非敏感波長清除由于容器上的劃痕、指印、背景等造成的干擾。TMB最大吸收波長為450 nm ,非敏感波長為630 nm ,一般不設空白孔,否則會出現吸光度值為負值的現象。加入終止液后應盡快比色,否則樣本吸光度值會逐漸下降,顯色越深下降越快,應在2 min 內比色。

  3.6 應加強檢測儀器的質量控制

  如定量移液器要定期校準;洗板機要及時傾倒廢液罐,補充洗滌液,開機后運行沖洗程序(雙蒸水),檢查系統液路系統(有無漏水),檢查吸液和注液速度,關機運行沖洗程序(雙蒸水),清洗吸針及水箱,儀器外觀清潔;酶標儀要定期檢查濾光片是否合格,光源是否穩定,機械系統是否有故障,保持外觀清潔,并定期請廠家工程師進行保養維修;水浴箱及存放試劑的冰箱要每天監測溫度,并有記錄等。

  4 結果的判定與報告

  4.1 結果的判定

  嚴格依據試劑盒提供的陽性判定值(CO)進行結果判定。廠商提供試劑的同時,說明書上列出的CO值是建立在一系列科學試驗及統計研究的基礎上,不應隨意更改。定量測定需要制備標準曲線,根據標準曲線計算結果。

  4.2 灰區的設置

  通常情況下ELISA結果報告方式為“陰性"或“陽性",在二者之間有一條明確的分界線,也就是所謂的陽性判定值即CO值,對于樣本的吸光度值(A)高于CO值就判斷為陽性,相反則判斷為陰性,然而在實際工作中經常會出現樣本A 值位于CO 值附近的人群,即ELISA 檢測的“灰區"。在國內的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及到“灰區"的設置,僅僅依靠CO值來決定感染的有無,尤其是對獻血員的篩查具有較大風險。筆者在實際工作中發現,結果處于CO值附近的患者重復性很差,也是容易引起醫療糾紛的人群。因此對于檢測結果位于“灰區"的患者可采用確認試驗或追蹤檢測方法加以確診。

  4.3 標本的復查

  ELISA 手工操作過程復雜,影響因素較多,即使室內質控在控,也可能因孔間差異而造成結果差異,因此制定復查制度及加大復查力度可保證結果的準確性,比如對乙肝“兩對半"處于“灰區"的標本及少見模式的檢測結果進行復查。本院在實際工作中嚴格執行復查制度,取得了較好的效果。

  5 質量控制

  5.1 室內質量控制(IQC)

  要保證檢驗結果的準確可靠,必須做好IQC,首先要保證實驗室的環境、儀器設備與硬件設施必須處于良好的狀態,其次要對試劑及測定方法過程進行理想化,另外實驗室技術人員必須經過良好的培訓。ELISA 定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體,與檢出量無關。因此質量控制要保證試驗的靈敏度,目前國內實驗室定性試驗的質控規則還沒有統一的標準,較多單位采用“即刻法",結合LeveyJennings 質控圖的方法。在每塊反應板中除了試劑盒附帶的陰陽性對照外,還要選擇至少2個室內質控品,其中一個為弱陽性的質控品接近CO值,S/CO值應該為2~4之間,另一個為陰性質控品。認真分析每次IQC失控的原因,定期對各項檢測的均值、變異系數等進行比對分析,及時發現試劑盒檢出能力的變化,采取適當的措施來提高檢測的可靠性。

  5.2 室間質量評價(EQA)

  EQA 是一種回顧性評價,主要是控制實驗室結果的準確性。其要點是保證同一患者的標本一樣對待室間質評物,必須強調的是EQA結果必須同IQC一并分析,找出原因,改進工作中的不足,同時指導實驗室選擇合適的試劑盒。

  綜上所述,ELISA檢測操作步驟復雜,可能會影響測定結果的因素較多,分布在測定操作的各個步驟中,因此必須加強各環節的質量控制,才能得到準確可靠的檢測結果。

  ELISA 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品,勵志研發和銷售的綜合性生物公司,產品遠銷多個國家和地區,我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向,不斷開發高質量的新產品,提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒

分享到:

返回列表 | 返回頂部
上一篇 : 古朵闡述:大鼠ELISA試劑盒的試驗關鍵點及試驗中需用的試劑    下一篇 :  古朵帶您了解、選購胎牛血清(FBS)的四個要點
網站首頁 公司簡介 產品中心 招聘中心 技術支持 企業動態 聯系我們 管理登陸
上海古朵生物科技有限公司版權所有 主營:優質胎牛血清,EA36染色液配制,迪夫快速染色液
GoogleSitemap ICP備案號:滬ICP備19048203號-2 技術支持:智慧城市網
在線客服
在线不卡日本v一区_91亚洲精品在看在线观看高_国产老女人精品视频_999久久久国产精品